人类大脑皮层的快速进化扩张被认为是实现人类特有认知功能的重要一步。最近的比较基因组研究已经确定了多个潜在人类特有功能的DNA序列，这些区域被认为在人类进化中发挥了重要的作用。因为它们是人类基因组进化最快的区域，因此被统称为人类加速区域(HARs)。HAR是人类基因组中高度保守的基因组元件，这表明它们在执行基本功能的同时，也选择性地在人类谱系中显示出快速的序列变化。
9月2日，发表在《Cell》旗下期刊《Neuron》上一个标题为“Rewiringofhumanneurodevelopmentalgeneregulatoryprogramsbyhumanacceleratedregions”的研究对超过个HAR在体外和活体中的调节活性进行了分析，这些HAR横跨人和小鼠的多种细胞类型和组织，结果证实了近一半的HAR在人类大脑发育重塑过程中发挥了重要作用。
HAR元件在体外表现出普遍的神经增强剂活性
研究人员首先开发了一种新的并行报告基因检测技术（MPRA），称之为CaptureMPRA(CaM-PRA)，该技术利用条形码分子反转探针（MIP）来捕获bp的HAR目标序列，然后在单个试管实验中评估这些序列的增强子活性(图1A)。通过，CaM-PRA克服了与标准MPRA设计相关的许多长度限制，从而能够对平均长度为bp的HAR进行系统评估。然后，将CaM-PRA方法应用于所有个已报告的HAR及黑猩猩成对的同源区域。总体而言，49%的元件在人类神经细胞中显示出可重复和显著的增强子活性(图1B)，表明这些HARs具有普遍的神经前体样增强子活性。此外，具有增强子活性的HAR富含已知在皮质神经发生中起重要作用的转录调节因子(RBPJ、TBR2[EOMES]、PAX6、Atoh1和TEAD)的结合基序，这表明很多HAR是神经发育的增强剂。
人类特有的HARs顺式调节体系结构的重排
为了确定人类独特的HAR序列差异元件是否与神经增强子活性的变化有关，作者们比较了HAR和黑猩猩同源区域的增强子活性(图1B)。总体而言，61%具有CaM-PRA增强子活性的HARs在人类和黑猩猩同源序列之间表现出明显的增强子活性变化。值得注意的是，人类特有的序列差异似乎更常与增强子活性增加有关，其中68%的元件表现出不同的增强子活性，对人类的活性比黑猩猩同源区域的活性更高(图1C)。这表明人类谱系中HAR元件的顺式调节活性发生了广泛的进化重排。为了弄清顺式调控效应对HAR元件增强子活性重排的贡献，作者还比较了人(SH-SY5Y)和小鼠(Neuro2a/N2A)神经细胞系(图1D)中各元件的增强子活性。结果表明，94%以上的元件在人和小鼠细胞中表现出相似的增强子活性，表明人和小鼠神经反式调节区段的不同并不明显改变每个HAR元件的整体增强活性。因此，人类特有的HAR元件增强子活性的重排主要是由顺式调控变异驱动的(图1E)。
HAR在人脑发育过程中显示出活体增强子的特征
为了确定HAR元件在人脑发育过程中是否表现出活体增强子活性的特征，作者使用DNaseI超敏活性映射(DNaseI-seq)和染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析了不同发育细胞类型和组织中HAR元件的染色质状态，以寻找增强子相关的染色质标记。观察到78%的HAR在至少一种测试的人类细胞或组织中显示出染色质可及性，56%在人类脑组织中显示染色质可及性(图2A和2B)。与成人脑组织相比，HAR元件优先在胎儿组织中可及(图2C，S2B)，进一步暗示HAR是参与人类大脑发育的神经发育调节元件。
为了测试HAR作为细胞类型特异性神经发育增强剂的潜力，使用荧光激活的核分选(FANS)从人胎脑组织(孕周[GW]19-20)分离了神经祖细胞（NPC）和成熟神经元，并探索了与增强子活性相关的染色质特征(即H3K4me1、H3K27ac和染色质可及性)(图2D)。个HAR在GW19-GW20NPC或成熟神经元中显示出与活体增强子活性一致的染色质特征(如与H3K4me1/H3K27ac芯片序列峰重叠)(图2G)。与NPC或神经元中的其他DNaseI超敏反应位点（DHS）相比，重叠区域DHSS的HAR元件显著富集(图2H)。H3K4me1和H3K27acChiP-seq峰的大部分是NPC或成熟神经元所独有的(图2E和2F)，这些发现暗示很大一部分HAR是参与人类特异性神经元发育的调控元件。
PPP1R17是一种假定HAR调节神经发育基因
作者接下来整合了CaM-PRA、DNaseI-seq和ChIP-seq的HAR数据，以确定一组核心的HAR，这些HAR代表可能有助于人类大脑皮层迅速扩张的神经发育增强剂。该方法在离体和活体组织中鉴定出个与神经发育增强子活性一致的HAR(图3A)。将这个假定的神经发育增强子HAR与来自人类胎儿皮质的染色质构象数据(HIC)重叠，结果表明，这个HAR由于与胎儿皮质中的靶基因有远程染色质相互作用而富集，进一步证明了这些HAR在人类神经发育中的活体增强活性。总共有63个HAR除了与人类胎儿皮层中的靶基因进行远程染色质相互作用外还表现出神经发育增强剂活性。HAR和PPP1R17之间的相互作用之所以突出，是因为PPP1R17拓扑相关结构域(TAD)中包含一个PPP1R17启动子近端灵长类选择性调节元件以及两个HAR，它们与PPP1R17基因启动子具有很强的胎脑远程染色质相互作用(图3B-3E)。这表明在非人类灵长类动物和人类进化过程中，PPP1R17的表达发生了广泛的重排。靶向色谱捕获(3C)相互作用分析证实了PPP1R17启动子与HAR和HAR在培养神经细胞中的选择性相互作用(图3C)，提示这两个序列可能在调节PPP1R17神经表达中起作用。
灵长类动物PPP1R17在发育过程中大脑皮质的表达
为了确定PPP1R17表达在哺乳动物进化过程中的细胞类型特异性和区域分布，作者检测了小鼠、雪貂、猕猴和人类大脑发育中不同区域的PPP1R17表达，并比较了其在无脑回（大脑皮质层中隆起的部分）哺乳动物、多脑回哺乳动物和灵长类动物中的表达模式。发现PPP1R17在所有四种母体的成年小脑浦肯野细胞中都有高表达。但在发育中的大脑皮层显示出高度的差异性表达，在灵长类动物中高表达，但在年龄相仿的中没有检测到(图4C)。PPP1R17在产前猕猴和人的皮质中的表达定位于室内外区(分别为OSVZ和iSVZ)(图4C)，不包括在脑室区和脑室区(图4C)。PPP1R17在发育中的大脑皮层表达高度多样化，在灵长类动物中高表达，相反，在发育过程中，PPP1R17在小鼠和雪貂的新皮质中不表达(图4C)，因此这种表达是灵长类动物中特有的。灵长类动物皮层SVZ表达的增加与小鼠和人类在PPP1R17基因周围染色质可及性方面的差异相似(图3E)。
PPP1R17细胞类型分布的人类特异性差异
除了灵长类和非灵长类动物早期皮质表达的变化外，对猕猴和人类大脑不同区域在胎儿和成年生活的不同阶段的RNA测序(RNA-seq)数据的比较发现，人与猕猴在PPP1R17表达上存在额外的、显著的差异(图5A)，免疫荧光分析证实了这一点。
具体地说，RNA-seq分析显示PPP1R17在猕猴和人的成年小脑和胎儿皮层NPC中的表达高度一致(图5A)。然而，在人类中，PPP1R17的皮质表达仅限于胚胎发育时期，并且与TBR2的表达时间进程密切匹配。相反，在猕猴中，PPP1R17在神经发生停止后仍然表达，甚至直到成年，不符合TBR2的表达模式(图5A)。PPP1R17在成年猕猴皮层的晚期表达不是由NPC或神经元的表达驱动的，而是由皮质星形胶质细胞的PPP1R17表达驱动的(图5B)，表明表明灵长类中PPP1R17表达模式的进一步分化。总之，PPP1R17在NPC（特别是中间祖细胞）中的表达具有灵长类特异性。
PPP1R17调节NPC周期进程
为了评估PPP1R17在细胞周期调节中的作用如推测的那样，作者评估了PPP1R17错误表达对小鼠初级皮质神经球的影响。用PPP1R17结构体电穿孔的神经球比用绿色荧光蛋白（GFP）结构体电穿孔的神经球小36%，但细胞死亡没有增加（图6A），证明PPP1R17是NPC增殖的调节剂。为了测试这种效应是否至少部分是通过G1/S（细胞分裂周期）转换介导的，接下来在基因编码G1期小鼠神经细胞中错误表达PPP1R17。PPP1R17错误表达的细胞是对照组细胞的分裂速度的一半，并且G1期延长了（图6B）。这些结果表明PPP1R17是G1/S过渡和NPC细胞周期进程的调节器。
该团队还开发了一个易于搜索的在线资源库（HARHub），包含了本次研究的新数据和之前发表的常见和罕见人类HAR序列变异数据集。
结语
该研究通过询问人类神经发育过程中的多个HAR的表观遗传学图景，证明了近一半的HAR是神经发育增强剂，并且这些HAR的顺式调控结构已经进行了人类特有的重排。此外，HAR人类特异性的改变增强了它们在神经细胞内的增强子活性，这可能促进了人类大脑的进化。利用CaM-PRA对90%以上的HAR元件的增强子活性进行评估，比传统的寡基MPRA更具优势，因为传统MPRA的序列长度通常限制在小于bp的插入片段，代表不到完整HAR元件，因为HAR元件的平均长度为bp。总之，从灵长类特有到人类特有的神经发育调节元件的表达，都暗示了神经元的发育对人类的进化成今天的样子起到了至关重要的作用。
原文链接：
转载请注明：http://www.0431gb208.com/sjszyzl/4780.html
