Qi如果想要了解细胞中信号、代谢和其他生化活动之间复杂的调节关系，通常有必要研究它们在多种扰动条件下的动力学，而基因编码的荧光生物传感器作为一种多功能工具，可以用于连续监测活细胞中各种生化活动，同时揭示在整体检测中被忽视的细胞间异质性。然而，由于荧光蛋白的宽发射光谱和可用谱空间的有限性，目前只能对少数生物传感器进行成像。近日，来自约翰霍普金斯医学院的Chuan-HsiangHuang团队在Cell杂志上发表了一篇题为Decipheringcellsignalingnetworkswithmassivelymultiplexedbiosensorbarcoding的文章，该团队开发了一种“生物传感器条形码”，表达不同生物传感器的条形码细胞混合物通过深度学习模型同时成像和分析，可以实现对信号事件的大规模多路复用跟踪。在这篇文章中，他们利用这一方法揭示了KRAS突变细胞的自主和非自主效应、受体酪氨酸激酶信号网络中效应子响应的不同模式等，该团队提供了一种可用于破译信号网络复杂性的可扩展的方法。为了确保条形码的可靠识别，该团队在创建条形码时要求只包括：1）不同颜色的两种条形码蛋白质的组合；2）靶向不同的亚细胞位置。此外，条形码蛋白还需要在光谱上与生物传感器分离，通常情况下大量荧光生物传感器用于检测：1）单个荧光团的细胞内定位或强度的变化（GFP）；2）供体和受体之间的FRET效率（CFP和YFP），因此发射光谱范围约在-nm。根据上述要求，该团队构建了与靶向基序融合的TagRFP、mCardinal、iRFP或BFP质粒，用于定位到细胞膜、细胞核、核膜、细胞质中，并在配备光谱检测器的共聚焦显微镜下拍摄表达成对条形码蛋白的细胞图像，在了解单个荧光团的参考发射曲线后，每个荧光团的贡献可以通过线性分解来确定，因此，使用针对四个亚细胞位置的四个荧光蛋白，总共可以生成72个条形码（图1）。图1.生物传感器条形码设计示意图接下来，该团队选择了可报告亚细胞中14个不同目标的活性的24个FRET或单荧光团生物传感器，通过瞬转，在Hela细胞中将每个传感器与一对独特的条形码蛋白共表达，再将具有不同生物传感器/条形码组合的细胞混合并成像，同时，也将来自混合条形码的结果与来自表达单个生物传感器的同质细胞群的结果进行比较。结果表明这种生物传感器条形码方法可以在混合条件下正确识别表达不同生物传感器的细胞，可以促进多种细胞活动的综合识别和动力学表征。在这基础上，该团队开发了用于自动条形码读取的深度学习模型，平均准确度为97%，且极大地节省了成像分析的时间（例如分析个细胞，人需要2hrs；而模型仅需10s）。此外，不仅是Hela细胞系，该团队还证明深度学习模型的条形码读取可以推广到其他细胞系中。对混合物中不同细胞群进行编码的能力使得区分细胞自主和非自主相互作用成为可能。比如说，利用法尼基化对KRAS的膜定位，BFP融合的KRAS（WT或G12V）作为条形码蛋白，将两组细胞混合。有趣的是，混合物中对照组细胞显示出双相反应，可能发生了KRASG12V细胞介导的非自主效应，也就是说KRASG12V可能通过MMP或ADAM家族的金属蛋白酶，释放EGFR配体，介导ERK激活在细胞混合物中的传播，倘若使用MMP/ADAM抑制剂预先处理混合物，则对对照组细胞的影响几乎被消除。此外，KRASG12V细胞中的几种生物传感器活性也发生改变，通过这种方法展示了KRASG12V以细胞自主和非自主方式对受体酪氨酸激酶（RTK）信号网络中不同节点的不同影响。类似地，在这篇文章中，该团队也利用这种工具研究了RTK信号网络中多个下游效应子对不同浓度的EGF和抑制剂的反应，揭示了不同效应子参与响应的不同模式。总的来说，在各种应用场景下同时跟踪多个生物传感器的需求日益增加，这一工具的开发对于重建复杂的分子网络、描绘不同细胞类型之间的信号相互作用以及识别药物靶向的分子途径而言具有重要意义。虽然在这里该团队只展示了使用CFP-YFPFRET和GFP生物传感器的条形码，但这一技术可以很容易的扩展到其他类型的具有相似发射光谱的荧光或生物发光生物传感器。原文链接：
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